A NITRIT/NITRÁT PLAZMASZINTEK ÉS AZ ANTIOXIDÁNS STATUS VIZSGÁLATA 1-ES TÍPUSÚ CUKORBETEGSÉGBEN SZENVEDÖKBEN

Összefoglalás

A hyperglykaemia által fokozott oxidatív stresszhatás, az antioxidáns védekezö rendszer csökkent müködése - amelyek következményeképpen létrejöhet a prooxidáns-antioxidáns rendszer egyensúlyának felborulása - hozzájárulhat az endothelialis nitrogén-monoxid inaktiválásához. E koncepció alapján cukorbetegekben a normoglykaemiára való törekvés az endothelium müködésének megörzését, a vascularis szövödmények megelözését biztosíthatja. A szerzök 24, kielégítö anyagcsere-egyensúlyú (HbA1c : 7,5?1,8%), intenzív-konzervatív inzulinkezelést folytató, 1-es típusú cukorbetegben (életkor: 36,3?12,7 év, 11 férfi/13 nö, diabetestartam: 9,8?7,2 év; x?SD) és 40 illesztett kontrollegyénben vizsgálták az antioxidáns statust, a lipidperoxidációt és a nitrogén-monoxid alap-metabolizmus stabil végtermékeit. Nem találtak különbséget a plazma nitrát/nitrit koncentrációja, a lipidperoxidáció foka és az antioxidáns rendszer paraméterei vonatkozásában a cukorbetegek és a kontrollok között. Az eredmények alapján kielégítö anyagcserekontroll mellett a vérben nem mutatható ki sem az oxidáns-antioxidáns rendszer egyensúlyának felborulása, sem a nitrogén-monoxid alap-metabolizmus végtermékei plazmakoncentrációjának változása 1-es típusú cukorbetegségben.

Kulcsszavak: nitrogén-monoxid, oxidatív stressz, antioxidáns rendszer

Key words: nitric oxide, oxidative stress, antioxidant system

A diabetes mellitust kísérö érfalkárosodások, a felgyorsult atherosclerosis alapvetö szerepet játszanak a cukorbetegek cardiovascularis eredetü morbiditásában, mortalitásában. Az érfal károsodásának korai, még a morfológiai változások elött megfigyelhetö jele az érfali reaktivitás és permeabilitás megváltozása. Ennek hátterében az érfali endothelium müködésének, ezen belül az endothelialis vasoactiv faktorok termelésének, hatásának módosulása áll.1,2 Ezen faktorok közül az egyik legjelentösebb az endothelialis nitrogén-monoxid (NO), amely komplex antiatherogen hatását vasodilatator müködése mellett az érfali simaizom-proliferáció, a thrombocyta-, leukocyta-adhézió és -aggregáció gátlása, antioxidáns képessége útján fejti ki.3,4 Az endothelialis NO hatásának csökkenése így több úton keresztül is hozzájárulhat az érfal atherothromboticus átalakulásához.

A diabetes mellitusban megfigyelhetö endothelkárosodás patomechanizmusa nem tisztázott, de más tényezök mellett több vizsgálat utal a hyperglykaemia által kiváltott fokozott mértékü oxidatív stressz lehetséges kóroki szerepére is.5,6,7,8,9 A hyperglykaemia több úton keresztül vezethet fokozott mértékü szabadgyök-termeléshez. Fokozódik a nem-diabeteses szervezetben is zajló glukóz autooxidáció, a nem-enzimatikus glikációhoz kapcsolódó glikoxidáció, mely ferro-vas és szuperoxidgyök, hidroxilgyök keletkezéséhez vezet,10,11 valamint a poliol anyagcsereút elötérbe kerülésével megváltozik a redox állapot, csökken a természetes antioxidánsok regenerációja, az antioxidáns védelem is.12 Ezen koncepció alapján a megbomlott prooxidáns-antioxidáns egyensúly többek között az endothelialis NO - elsösorban a szuperoxid-anion által történö - inaktiválását eredményezi.3,13

A reaktív szabad gyökök, így az NO direkt mérése igen rövid életidejük miatt nehezen valósítható meg. Koncentrációjukra hatásuk, végtermékeik, vagy a termelésükben és eliminációjukban részt vevö enzimek, szubsztrátok vizsgálatából, méréséböl következtetnek. Ezen közvetett módszerek alkalmazásával mind diabeteses állatokban, mind diabeteses betegek vizsgálatakor fokozott,14 változatlan 15,16 és csökkent endothelialis NO-termelésröl és hatásról 17,18,19,20,21 egyaránt beszámolnak.

Vizsgálatunk célja annak megítélése volt, hogy megfelelö szénhidrátanyagcsere-állapot mellett kimutatható-e eltérés az NO alap-metabolizmus stabil végtermékeinek koncentrációjában, az oxidatív stressz mértékében és az antioxidáns védekezö rendszer állapotában 1-es típusú cukorbetegségben megbetegedettekben, illetve igazolható-e összefüggés ezen paraméterek és a késöi diabeteses szövödmények jelenléte között.

Betegek és módszerek

A vizsgálatba 24, járóbetegként gondozott, átlagosan 10 év diabetestartamú, 1-es típusú cukorbetegségben megbetegedett személyt és 40 illesztett egészséges kontrollegyént vontunk be. A cukorbetegek intenzív-konzervatív inzulinkezelést folytattak, nem szenvedtek szívelégtelenségben, hematológiai, rosszindulatú daganatos vagy májbetegségben, nem álltak hormonkezelés alatt, nem szedtek vitamin- vagy antioxidáns hatású készítményeket, nem-szteroid gyulladásgátló vagy thrombocyta aggregációgátló szereket. Késöi diabeteses szövödmények vonatkozásában 8 betegnek volt pozitív az anamnézise (háttér-retinopathia, microalbuminuria, sensoros, illetve autonom neuropathia).

A reggeli éhgyomri (legutolsó étkezést követöen legalább 8 órával), adalék nélküli natív, standard EDTA-, illetve Na-heparin-tartalmú Vacutainer csövekbe vett vénás vérmintákat azonnal jeges vízfürdöbe tettük, centrifugálás után (3000 g, 4 °C, 10 perc) a szérumot/plazmát és a vörösvértestmasszát szétválasztottuk.

A vércukor, a triglycerid, a cholesterin, a HDL-cholesterin, a húgysav, a creatinin, az albumin mérése Hitachi 717 laboratóriumi automatán (Diapack, Dialab GmbH, Bécs, Ausztria), az LDL-cholesterin mérése precipitációs módszerrel, kolorimetriával (BioMerieux, Marcy l'étoile, Franciaország), a HbA1c meghatározása Abbot IMX analyseren (Abbot Laboratories, Abbot Park, Illinois, USA, referenciaérték: 4,4-6,4%) történt.

A szulfhidrilcsoport (-SH) meghatározását spektrofotometriás módszerrel, Ellmann-reagenssel,22 a glutation-peroxidáz (GSHPx) aktivitásának mérését Paglia és Valentine módszere 23 szerint (Ransel, Randox Laboratories Ltd., Antrim, Egyesült Királyság) végeztük. A szuperoxid-dizmutáz (SOD) aktivitásának meghatározása xantin-xantin oxidáz rendszerben (Ransod, Randox Laboratories Ltd., Antrim, Egyesült Királyság), a glutation-reduktázé (GRED) NADPH mellett az oxidált glutation redukciójának meghatározásával (Glutathione-reductase, Randox Laboratories Ltd., Antrim, Egyesült Királyság) történt. A lipid-peroxidáció végtermékeit tiobarbitursavas (TBARS) módszerrel, 24 a plazma teljes antioxidáns statusát (TAS) azino-bis-etil-benzo-tiazolin-szulfonsav (ABTS) szabad gyök gátlás módszerével (Total Antioxidant Status, Randox Laboratories Ltd., Antrim, Egyesült Királyság) szintén spektrofotometriával határoztuk meg.

Az NO-tartalom vizsgálatára a plazma NO2 +NO3 koncentrációjának meghatározását használtuk. Az NO vizes oldatban oxigén jelenlétében nitritté és nitráttá alakul. A plazma cinkszulfáttal történö fehérjementesítése után a nitrátot kadmium-gyöngyökkel nitritté redukáltuk, majd kolorimetriás módszerrel, Griess-reagenssel (Bioxytech, Oxis International Inc., Portland, Oregon, USA) mértük a minták nitrittartalmát.

A vizsgálatot a betegek felvilágosítása és írásbeli beleegyezése után végeztük el, a TUKEB 112/1996 számú etikai engedélye alapján.

A statisztikai feldolgozás Microsoft Excel és SAS R program (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) GLM, illetve NPAR1WAY (Savage kétmintás próba) és CORR eljárásának felhasználásával történt. A szignifikancia szintjét 0,05-nak rögzítettük. Az átlagértékek mellett feltüntettük a szórást is (x?SD).

Eredmények

A cukorbetegek és a kor, nem, test-tömeg index szerint illesztett kontrollegyének (1. táblázat) lipidparamétereiben és vesefunkciós értékében sem mutatkozott eltérés. Nem találtunk értékelhetö különbséget a cukorbetegek és a kontrollegyének között a plazma NO2 +NO3 koncentrációja, a vörösvértestek antioxidáns enzimrendszere és a lipidperoxidáció végtermékeinek koncentrációja vonatkozásában. Az alcsoportként vizsgált, a kísérlet

1. táblázat: A vizsgálatba vont cukorbetegek és kontrollegyének klinikai és laboratóriumi adatai (x?SD)

idején elfogadható anyagcsere-állapotú (HbA1c : 7,8?1,6%, szérum cholesterin: 5,6?1,4 mmol/l, triglycerid: 1,3?0,5 mmol/l, HDL-cholesterin: 1,4?0,2 mmol/l, LDL-cholesterin: 3,5?1,2 mmol/l), késöi diabeteses szövödményekben szenvedö betegek (n=8) fenti paraméterei sem különböztek értékelhetöen a szövödménymentes cukorbetegekben és az egészséges kontrollegyénekben mért értékektöl. A szérum antioxidáns hatású molekulái közül mind a szövödményes, mind a szövödménymentes cukorbetegekben a húgysavszintet alacsonyabbnak találtuk a kontrollegyénekben mért értékeknél, az albumin és a szulfhidrilcsoportok mennyisége a szövödményes cukorbetegekben adódott értékelhetöen alacsonyabbnak, a teljes antioxidáns status azonban nem különbözött a csoportok között (2. táblázat).

Analízisünk nem igazolt szignifikáns korrelációt a NO2 /NO3 szint és az életkor, a diabetestartam, a szénhidrát-anyagcsere, az antioxidáns és az oxidatív károsodást jelzö vizsgált paraméterek között a cukorbetegekben (3. táblázat).

3. táblázat: A nitrit+nitrát plazmaszintek és a vizsgált paraméterek kapcsolata a cukorbetegekben

Megbeszélés

Vizsgálatunkban a kielégítö anyagcsereállapotú, 1-es típusú cukorbetegségben megbetegedett személyek plazmájában nem mutatkozott különbség az NO2 /NO3 koncentrációban, az oxidatív stresszt és antioxidáns kapacitásukat jellemzö paramétereik is az egészséges kontrollokhoz hasonló értékeket mutattak. A jelenleg elfogadható anyagcsere-állapotú, de késöi diabetes-specifikus szövödményt mutató betegek paraméterei közül a plazma antioxidáns hatású molekuláiban mutatkozott eltérés.

A cukorbetegek érrendszeri szövödményeinek megelözése, progressziójuk lassítása szempontjából nagy jelentösége van a veszélyeztetettek minél korábbi felismerésének, adekvát kezelésük meg-kezdésének. Az endothel-diszfunkció - az érfalkárosodás korai jelzöje - nem invazív módon történö felismerése, markereinek mérése a preventív medicina növekvö fontosságú feladata lesz. Az endothelialis NO indirekt meghatározása is ezt a célt szolgálja.

A plazma és a vizelet NO2 +NO3 koncentrációjának mérése könnyen kivitelezhetö módszere az NO indirekt meghatározásának. A módszer hátránya, hogy a táplálékkal, illetve ivóvízzel vagy belégzéssel a szervezetbe bevitt NO2 +NO3 , az immunológiai reakciók során keletkezö NO végtermékei is mérésre kerülnek.

Emellett a vizelet vizsgálatánál a baktériumok jelenléte, illetve diabeteses nephropathiában a kezdeti hyperfiltratio tévesen magas eredményt adhat. Hasonló táplálkozási szokású, illetve ivóvizet fogyasztó populációnál a cukorbeteg és anyagcsere-egészséges kontrollszemélyek összehasonlítására a plazma NO2 +NO3 szintjének vizsgálata alkalmasabbnak tünik.25

A hyperglykaemia és a késöi szövödmények kialakulása közti kapcsolat egyértelmü bizonyítékát a Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) jelentette.26 A közel-normoglykaemia elérése és fenntartása a késöi szövödmények kialakulásának

megelözését, progressziójuk lassítását biztosítja. Az endothel-diszfunkció szénhidrátanyagcsere-állapottal való összefüggését állatkísérletekben igazolták.27 A humán vizsgálatok eredményei kevésbé egyértelmüek, de több tanulmány utal a jó anyagcsere-állapot fenntartásának jelentöségére az endothelfunkció megörzésében.

Az NO alap-metabolizmus vizsgálata mellett az endothelfunkció megítélésére használt próbák - az invazív kvantitatív coronarographia, illetve az egyszerübben kivitelezhetö, nem invazív, acetilkolin vagy reaktív hyperaemia provokálta áramlásváltozás mérése az alkari arteriában Doppler- áramlásmérö segítségével - adhatnak további felvilágosítást az esetleges endothelkárosodás kimutatására. Jó anyagcsere-állapotú, hosszú diabetestartamú (21,5?10,2 év), 1-es típusú cukorbetegségben megbetegedettek endothelfunkcióját vizsgálva Enderle és mtsai nem találtak különbséget az egészséges kontrollcsoporthoz viszonyítva. 16 Közel-normoglykaemia biztosítása mellett Huvers és mtsai sem mutattak ki eltérést az endothelium-függö vasodilatatióban sem szövödménymentes, sem késöi szövödményekkel bíró cukorbetegekben.28

Eredményeinket összegezve megállapítható, hogy kielégítö szénhidrát- és lipidanyagcsere-állapotú, 1-es típusú cukorbetegségben megbetegedett személyek NO alap-metabolizmusa, oxidatív stresszt és antioxidáns kapacitásukat jellemzö paraméterei nem mutatnak eltérést az egészséges kontrollegyénekhez képest.

Köszönetnyilvánítás

A vizsgálat "A hepatológia immunológiai és szabad gyökös vonatkozásai" PhD program "A szénhidrát és lipidanyagcsere kapcsolata a szabad gyökös reakciókkal és szerepük az atherosclerosis kialakulásában" alprogramja keretében, a T 02071/1997 számú ETT és T 025920/1997 számú OTKA pályázatok és a Zsigmond Diabetes Alapítvány támogatásával készült.

IRODALOM

1. Cohen, RA: The role of nitric oxide and other endothelium-derived vasoactive substances in vascular disease. Prog Cardiovasc Dis 38: 105-128, 1995.

2. Harrison, DG: Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. J Clin Invest 100: 2153-2157, 1997.

3. Münzel, T, Heitzer, T, Harrison, DG: The physiology and pathophysiology of the nitric oxide/superoxide system. Herz 22: 158-172, 1997.

4. Mohácsi A, Kozlovszky B, Seres I, Csabina S, Paragh G, Boda J, Fülöp T: Humán atheroscleroticus arteria femoralis endothelfüggö relaxációjának és kontrakciójának vizsgálata in vitro körülmények között. Orv Hetil 138(Suppl 2): 2311-2316, 1997.

5. Ceriello, A, Quatraro, A, Caretta, F, Varano, R, Giugliano, D: Evidence for a possible role of free radicals in the abnormal functional arterial vasomotion in insulin-dependent diabetes. Diabete Metab 16: 318-322, 1990.

6. Baynes, JW: Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes 40: 405-412, 1991.

7. Somogyi A, Pusztai P, Prechl J, Fehér J: A diabetes mellitus és a szabadgyökös reakciók feltételezett kapcsolata az érelmeszesedéssel. Orv Hetil 135: 1815-1818, 1994.

8. Diederich, D, Skopec, J, Diederich, A, Dai, FX: Endothelial dysfunction in mesenteric resistance arteries of diabetic rats: role of free radicals. Am J Physiol 266: 1153-1161, 1994.

9. Giugliano, D, Ceriello, A, Paolisso, G: Oxidative stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care 19: 257-267, 1996.

10. Ceriello, A: Hyperglycaemia: the bridge between non-enzymatic glycation and oxidative stress in the pathogenesis of diabetic complications. Diab Nutr Metab 12: 42-46, 1999.

11. Wittmann I, Wagner Z, Wagner L, Mazák I, Nagy J: A nem-enzimatikus glikáció szerepe az öregedés, az atherosclerosis és a diabeteses nephropathia patofiziológiájában és klinikai képének alakulásában. Diabetologia Hungarica 7: 9-21, 1999.

12. Sobrevia, L, Mann, GE: Dysfunction of the endothelial nitric oxide signalling pathway in diabetes and hyperglycaemia. Exp Physiol 82: 423-452, 1997.

13. Cosentino, F, Hishikawa, K, Katusic, ZS, Luscher, TF: High glucose increases nitric oxide synthase expression and superoxide anion generation in human aortic endothelial cells. Circulation 96: 25-28, 1997.

14. Pieper, GM, Dembny, K, Siebeneich, W: Long-term treatment in vivo with NOX-101, a scavenger of nitric oxide, prevents diabetes-induced endothelial dysfunction. Diabetologia 41: 1220-1226, 1998.

15. Brands, MW, Fitzgerald, SM: Acute endothelium-mediated vasodilation is not impaired at the onset of diabetes. Hypertension 32: 541-547, 1998.

16. Enderle, MD, Benda, N, Schmuelling, RM, Haering, HU, Pfohl, M: Preserved endothelial function in IDDM patients but not in NIDDM patients compared with healthy subjects.Diabetes Care 21: 271-277,   1998.

17. Rösen, P, Ballhausen, T, Stockklauser, K: Impairment of endothelium dependent relaxation in the diabetic rat heart: mechanisms and implications. Diabetes Res Clin Pract 31(Suppl): 143-155, 1996.

18. Trachtman, H, Futterweit, S, Crimmins, DL: High glucose inhibits nitric oxide production in cultured rat mesangial cells. J Am Soc Nephrol 8: 1276-1282, 1997.

19. Wascher, TC, Bachernegg, M, Kickenweiz, A, Stark, G, Stark, U, Toplak, H, Graier, WF: Involvement of the L-arginine-nitric oxide pathway in hyperglycaemia-induced coronary artery dysfunction of isolated  guinea pig hearts. Eur J Clin Invest 26: 707-712, 1996.

20. Giugliano, D, Marfella, R, Coppola, L, Verrazzo, G, Acampora, R, Giunta, R, Nappo, F, Lucarelli, C, D'Onofrio, F: Vascular effects of acute hyperglycemia in humans are reversed by L-arginine. Evidence for reduced availability of nitric oxide during hyperglycemia. Circulation 95: 1783-1790, 1997.

21. Johnstone, MT, Creager, SJ, Kathleen, MS, Cusco, JA, Lee, BK, Creager, MA: Impaired endothelium dependent vasodilatation in patients with insulin-dependent diabetes mellitus. Circulation 88: 2510-2516, 1993.

22. Sedlak, J, Lindsay, RH: Estimation of total, protein-bound and non-protein sulfhydril groups in tissues with Ellmann's reagent. Anal Biochem 25: 192-205, 1968.

23. Paglia, DE, Valentine, WN: Studies on the quantitative and qualitative characterisation of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 70: 158-169, 1967.

24. Pyles, LA, Stejskal, EJ, Einzig, S: Spectrophotometric measurement of plasma thiobarbituric acid  reactive substances in the presence of hemoglobin and bilirubin interference. PSEBM 202: 407-419, 1993.

25. Moshage, H, Kok, B, Huizenga, JR, Jansen, PLM: Nitrite and nitrate determinations in plasma: a critical evaluation. Clin Chem 41: 892-896, 1995.

26. Diabetes Control and Complications Trial Research Group: The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. New Engl J Med 329: 977-986, 1993.

27. Rodriguez-Manas, L, Angulo, J, Peiro, C, Llergo, JL, Sanchez-Ferrer, A, Lopez-Doriga, P, Sanchez-Ferrer, CF: Endothelial dysfunction and metabolic control in streptozotocin-induced diabetic rats. Brit J Pharmacol 123: 1495-1502, 1998.

28. Huvers, FC, De Leeuw, PW, Houben, AJHM, De Haan, CHA, Hamulyak, K, Schouten, H, Wolffenbuttel, BHR, Schaper, NC: Endothelium-dependent vasodilatation, plasma markers of endothelial function, and adrenergic vasoconstrictor responses in type 1 diabetes under near-normoglycemic conditions. Diabetes 48: 1300-1307, 1999.