Somogyi Anikó dr., Prechl József dr., Pusztai Péter dr., Kocsis Ibolya, Szűcs Nikolette dr.

Összefoglalás

Summary

Key words: diabetes mellitus, free radicals, antioxidants, lipoproteins, atherosclerosis

Diabetes mellitusban szenvedő betegekben az érelmeszesedés klinikai tünetei fiatalabb életkorban jelentkeznek és gyorsabban progrediálnak, mint a nem-cukorbeteg egyénekben.¹ A felgyorsult érelmeszesedés okait vizsgálva, a kutatások a cukorbetegségben gyakori hyperlipoproteinaemiának vezető szerepet tulajdonítanak. Megválaszolatlan az a kérdés, hogy a cukorbetegség önállóan is, vagy csak a lipidanyagcserére kifejtett hatásán keresztül, és esetleg más tényezőkkel együtt - mint pl. az ún. metabolikus X-syndroma részeként² - jelent-e fokozott kockázatot.

A rosszul beállított cukorbetegség velejárója a hyperglykaemia és a lipidek mennyiségi és/vagy minőségi változása. A hyperglykaemia miatt glikozilálódnak a fehérjék és az LDL is.³ A glikozilációs reakció szabadgyököket termelő folyamatokat indukál.⁴ A fokozottan termelődő szabadgyökök oxidálhatják a lipideket. Számos vizsgálat igazolta, hogy az oxidált lipoproteinek részt vesznek az érelmeszesedés kialakulásában.^5,6

Úgy tűnik, hogy a diabeteseseken kialakuló érelmeszesedés folyamatában a szabadgyökös reakciók kulcsszerepet játszanak, mivel kapcsolatot teremtenek a kóros cukoranyagcsere és a lipidanyagcsere között.^7,8

A szabadgyökös reakciók szerepe a biológiai folyamatokban még nem teljesen tisztázott. A szabadgyökök kémiailag reaktívak, élettartamuk rövid és fiziológiás körülmények között az antioxidáns rendszer ellenőrzése alatt állnak.⁹ Toxikus szerepük csak akkor valószínűsíthető, ha az antioxidáns rendszer elégtelen működése igazolható. Az antioxidáns rendszer tagjai egymással szoros összefüggésben működnek. Szerepük több részre bontható. Egyrészt preventív, mivel megakadályozzák az aktív gyökök kialakulását, másrészt terápiás, mivel a már létrejött gyököket eltávolítják, semlegesítik, harmadrészt helyreállító, azáltal, hogy részt vesznek a gyökhatás következtében létrejött károsodások kijavításában-megszüntetésében. Az antioxidáns rendszer tagjait két csoportba lehet osztani: az antioxidáns enzimek és az antioxidáns vegyületek csoportjára.

A vér alakos elemei közül az erythrocyták nem tartalmaznak sejtmagot, mitochondriumokat és endoplasmaticus reticulumot, ennek megfelelően azok funkcióival sem rendelkeznek. A sejtmembrán lényegileg a haemoglobin túltelített oldatát fogja körül. Az erythrocyták anyagcseréje főleg a glukóz glikolitikus lebontásán alapul.

A vörösvértestekben a glukóz fiziológiás körülmények között két úton metabolizálódik: az Embden-Meyerhof-úton és a hexosmonophosphat-shuntön keresztül. Előbbin keresztül mintegy 90-95%-a metabolizálódik és ez az út a vörösvértest ATP szintézisének fő forrása. A hexosmonophosphat-shunt a glukóz 5-10%-ának utilizációjáért felelős és a NADPH fő forrása. Azokban az állapotokban, amikor a NADPH oxidációja fokozott, a glukóz 10-20-szor nagyobb mennyiségben metabolizálódik a hexosmonophosphat-shuntön keresztül. A NADPH fő feladata a haem-vas redukált állapotban tartása. A haem oxidációja során a vörösvértestekben haem oxiszabadgyökök szabadulnak fel (de nagy mennyiségben keletkeznek pl. oxidált phagocytákból gyulladás kapcsán, tumoros betegségekben, de számos más pathologiás állapotban is). Az erythrocyták funkciójukból következően állandóan védekeznek a külső és belső szabadgyök-képződéssel szemben. A sejtben nagy koncentrációban vannak jelen az antioxidáns rendszer tagjai - a glutation SH, a glutation peroxidáz, a szuperoxid dizmutáz, az E-vitamin - és jelentős a katalázaktivitás is. Mivel a vörösvértestek, endoneurium, szemlencse, Langerhans-szigetek glukózfelvételéhez nem szükséges inzulin, úgy tűnik, hogy hyperglykaemiában a megnövekedett glukózoxidáció a NADPH felszaporodásához vezet és előtérbe kerülnek a glukózoxidáció azon útjai - ez az ún. hyperglykaemiás pseudohypoxia -, melyek szabadgyöktermeléssel járnak.¹⁰ A szabadgyökök hatására károsodhatnak a telítetlen zsírsavak oldalláncai, a membránok és módosulhat a lipoproteinek cholesterinje. A keletkező organikus peroxidok - pl. a lipidperoxidok - nagy koncentrációban károsítják a membránokat, pl. a vörösvértest membránját.

Irodalmi adatok szerint a vörösvértestek vizsgálata alkalmas lehet arra, hogy képet nyerjünk az antioxidáns rendszer állapotáról különböző betegségekben,^11,12,13,14 azzal a kiegészítéssel, hogy az így kimutatott eltérésekből csak óvatosan következtethetünk a szervezet egészére vonatkozó változásokra. Diabetes mellitusban a vörösvértestek antioxidáns kapacitásának vizsgálatát az teszi különösen indokolttá, hogy glukózfelvételük nem inzulinfüggő, ezért az így kapott eltérések csak a hyperglykaemiától függenek. Munkánkban vizsgálni kívántuk, hogy diabetes mellitusban és hyperlipoproteinaemiában kimutatható-e a vörösvértestek szabadgyökfogó rendszerében (össz-scavanger kapacitás) változás a kontrollcsoporthoz képest.

Beteganyag és módszer

Munkánkban azt tanulmányoztuk, hogy a kóros szénhidrát- és lipidanyagcsere megváltoztatja-e a vörösvértestek össz-scavanger kapacitásértékét.

A Semmelweis OTE II. Belgyógyászati Klinikájának járóbeteg ambulanciáján ellenőrzött, illetve fekvő beteg osztályain kezelt I. és II. típusú diabetes mellitusban és/vagy hyperlipoproteinaemiában szenvedő betegeket vizsgáltunk. Átlagos életkoruk 46 (szélsőértékek 19-72) év volt. A vizsgáltak inzulinon vagy orális antidiabeticumon kívül a szénhidrát-anyagcserét befolyásoló egyéb gyógyszert nem szedtek. Ismert daganatos betegség, előrehaladott vese-, májbetegség, vérképzőszervi megbetegedés kizáró ok volt. Fogamzásgátlót, hormonkészítményeket, illetve zsírcsökkentő gyógyszert szedőket a vizsgálatból kizártuk. A vizsgált csoportok az alábbiak voltak:

I. típusú (IDDM) cukorbetegek (n=9 fő), II. típusú (NIDDM) nem-hyperlipoproteinaemiás cukorbetegek (n=12 fő), hyperlipoproteinaemiás (II.a, II.b, IV. típus) betegek (n=20 fő), NIDDM-ben megbetegedett hyperlipoproteinaemiás betegek (n=10 fő) és kontrollszemélyek (n=16 fő). Az egyes csoportok jellemző adatait az 1. táblázatban mutatjuk be. Az IDDM-ben szenvedők cukorbetegsége átlagosan 7,2 éve (szélsőértékek: 2-31 év), az NIDDM-ben szenvedők cukorbetegsége átlagosan 7,2 éve (szélsőértékek: 1-8 év) állt fenn. A zsíranyagcsere-zavarban és NIDDM-ben egyaránt szenvedők diabetese átlagosan 8,9 éve (1-25 év) volt ismert. A hyperlipoproteinaemia fennállásának időtartamáról biztos adatunk nem volt, és nem tudtuk meghatározni annak feno-, illetve genotípusát sem.

1. táblázat: A vizsgálati csoportok jellemzői

Az alábbi laboratóriumi értékeket mértük: vércukor (GOD-PAP, Boehringer-Mannheim), serum cholesterin (CHOD-PAP, Boehringer-Mannheim), triglycerid (GPO-PAP, Boehringer-Mannheim), HDL-cholesterin (foszfowolframat-MgCl₂-os kicsapás után enzimatikus kolorimetriás meghatározás, Roche+Boehringer-Mannheim), HbA_1c (immunturbidimetriás meghatározás, Boehringer-Mannheim), SGOT, SGPT (Alfa Dialab), gamma GT (Boehringer-Mannheim), serum kalium, natrium, creatinin, vérkép, 24 órás vizeletfehérje-ürítés rutin laboratóriumi eljárásokkal. Az enzimatikus meghatározások Hitachi-automatán, az ionmeghatározások ionszelektív elektródok segítségével indirekt potenciometriával történtek. A vérvételekre 12 órás éhezést követően került sor.

A vörösvértestek össz-scavanger kapacitását Horváth és Blázovics módszerét adaptálva¹⁵ Bertold-luminométeren (LB 95001 Lumat) határoztuk meg. A készülék 20 ns feloldással, 360-620 nm közötti spectralis érzékenységgel működik. A vörösvértesteket standard módszer szerint szeparáltuk. H₂O₂-luminol rendszerben vizsgáltuk a chemiluminescens fényintenzitás-változást, a mért értékeket relatív fényegységekben (RLU) adtuk meg. A vizsgálandó minta 3,44 ?M luminolt, 580 ?M Na₂CO₃-ot és 2,2 mM H₂O₂-ot tartalmazott végkoncentrációban. A vörösvértest-bemérés 3´ 10⁶ sejt volt. A méréseket szobahőmérsékleten végeztük. A 30 mp-ig mért minták RLU értékét a műszer automatikusan jelezte ki. A vörösvértestek össz-scavanger kapacitását a sejtmentes rendszer fényintenzitásához képest észlelt csökkenés százalékában fejeztük ki. A csoportok közötti különbségek értékelésére variancia analízist használtunk, a vizsgált paraméterek közötti kapcsolatok elemzésére korreláció analízist végeztünk a SIMSTAT statisztikai programcsomag segítségével.

A vizsgálatokat a Semmelweis OTE Tudományetikai és Kutatásetikai Bizottságának engedélyével (41/a/93), a betegek felvilágosítása és aláírással rögzített nyilatkozata után végeztük.

Eredmények

A vizsgálatokba a kontrollszemélyekkel együtt 67 beteget vontunk be. A hyperlipidaemia kritériumaként a serum cholesterin esetében az 5,5 mmol/l értéket elérő vagy meghaladó koncentrációt, a triglycerid értékeknél a 2,5 mmol/l-t elérő vagy meghaladó értéket tekintettük. Eredeti anyagunkban IDDM betegeink között is szerepeltek emelkedett vérzsírértékekkel rendelkezők. A kis esetszámra (n=4) tekintettel azonban e betegek adatait a jelen feldolgozásból kihagytuk.

A kontrollcsoporttal összehasonlítva minden vizsgált csoportban csökkent össz-scavanger kapacitást mértünk (2. táblázat), de szignifikáns változást csak IDDM-ben és a hyperlipoproteinaemiás NIDDM csoportban észleltünk. Az egyéb vizsgált mutatók közül az össz-scavanger kapacitás az aktuálisan mért vércukorszinttel negatív korrelációt mutatott (r= -0,32; p < 0,01). Egyéb vizsgált paraméterekkel nem találtunk szignifikáns összefüggést.

2. táblázat: A vörösvértestek össz-scavanger kapacitása a különböző vizsgálati csoportokban

Megbeszélés

Vizsgálatunkban I. és II. típusú diabetes mellitusban és/vagy hyperlipoproteinaemiában szenvedő betegek és egészséges egyének vörösvértesteinek össz-scavanger kapacitását hasonlítottuk össze. Azt találtuk, hogy az a kontrollokhoz képest minden betegcsoportban csökkent, szignifikáns változás azonban csak normális vérzsír értékekkel rendelkező IDDM betegeken, ill. a hyperlipoproteinaemiás NIDDM csoportban volt igazolható. Ismert, hogy az I. típusú cukorbetegségnek - hacsak nem áll fenn szélsőséges anyagcsere-kisiklás - nem szükségszerű velejárója a hyperlipoproteinaemia, de a zsíranyagcsere minőségi változásai, módosulásai ekkor is kimutathatók.¹⁶ Lehetséges hogy e zsíranyagcsere-változások és a gyökfogó rendszer aktivitása között összefüggést lehet kimutatni. E minőségi változások vizsgálatára azonban nem volt módunk. A II. típusú cukorbetegségben az anyagcsere romlása jelentősen befolyásolja a lipidanyagcsere mennyiségi mutatóit.¹⁶ A vizsgált II. típusú cukorbetegek mintegy fele szenvedett zsíranyagcsere-zavarban is, ezek össz-scavanger kapacitása jelentősen csökkent a kontrollokhoz és a másik NIDDM csoporthoz képest is.

Az érelmeszesedés következményeit (ischaemiás szívbetegség, agyi vascularis katasztrófa, stb.) és a rizikófaktorok kapcsolatát világszerte, nagy populációk adatait feldolgozva kutatják.^17,18 Nem tisztázott még, hogy a ma rizikótényezőnek tartott eltérések önállóan is befolyásolják-e az arteriosclerosis kialakulását, vagy csak a lipidanyagcserére kifejtett hatásukon keresztül. Az utóbbi évek vizsgálatai egyértelműen igazolták, hogy az érelmeszesedés kialakulása, és az érfalban keletkező cytokinek és oxidált lipidek között kapcsolat mutatható ki.¹⁹ Feltételezhető, hogy minden pathologiás folyamat, mely a lipideket módosító kóros termékek keletkezéséhez vezet, potenciálisan atherogen. Valószínű, hogy azok a betegségek, amelyek ugyan kóros mennyiségű szabadgyökképződéssel járnak (pl. bakteriális gyulladások, sérülések, stb.) de gyógyíthatók, a gyógyulási folyamat után már nem jelentenek rizikót. Azok a népbetegségek, melyek kezelhetők ugyan, de nem gyógyíthatók (pl. hypertonia, hyperlipoproteinaemia, diabetes mellitus, stb.) folyamatosan fenntartják "lipidmódosító" képességüket és elősegítik az érelmeszesedés kialakulását. Stein és mtsai feltételezik, hogy olyan egészségkárosító tényezők, mint a dohányzás is elsősorban akkor jelentenek nagy rizikót az ischaemiás szívbetegség kialakulásában, ha hyperlipoproteinaemiával együtt vannak jelen. Állításukat alátámasztják azok az epidemiológiai adatok, melyek igazolják, hogy pl. Japánban és Kínában, ahol az átlagos cholesterinszint alacsony, de magas a dohányosok száma, alacsonyabb az ischaemiás szívbetegség előfordulása mint Nyugat-Európában, ahol magasabb cholesterinszinttel társul a dohányzás.²⁰

A diabetes mellitus kezelésében az utóbbi években jelentős változás következett be. A szénhidrát-anyagcsere olyan ideális szintű beállítása, mely a vércukorértékek tekintetében megközelíti az egészséges egyénét, és csökkenti a hagyományos inzulinkezeléssel obligát módon együttjáró hyperinsulinismust - annak minden, pl. atheromatosist elősegítő következményének mérséklésével -, megteremti annak a lehetőségét is, hogy a cukorbetegség ne legyen többé az érelmeszesedés egyik rizikófaktora. A rossz anyagcsere-helyzetű diabetes mellitusban a hyperglykaemia következtében létrejövő glikozilációs folyamatok már feltárt forrásai annak, hogy - mintegy "melléktermékként" - olyan kóros folyamatok alakuljanak ki, melyek elősegítik az érelmeszesedés felgyorsulását. E jelenségek között - az érelmeszesedés szempontjából - kiemelt helyet foglal el az, hogy szabadgyökök indukálódnak, melyek kóros kémiai reakciókat indítanak el. A lipid peroxidáció, amelyet az instabil szabadgyökök indukálnak, a sejtmembrán telítetlen zsírsavait peroxi és hydroperoxi intermediereken keresztül autokatalitikus, autooxidációs láncreakciókban aldehidekre, alkoholokra, ketonokra stb. hasítja. A kóros szénhidrát-anyagcsere és szabadgyökfogó rendszer kapcsolatát célzó eddigi vizsgálatok főleg a lipidperoxidáció végtermékeinek kimutatására fektették a hangsúlyt. Igazolt például, hogy rossz anyagcsere-helyzetű cukorbetegeken a vörösvértest-membrán lipid peroxidációs folyamatai fokozódnak.^4,19 1991-ben Mooradian²¹ idős, II. típusú betegekben - akik diabeteses szövődményben szenvedtek - a serum konjugált dién-koncentráció növekedését találta, mely a serum triglycerid-szinttel jobban párhuzamba vonható volt, mint a serum glukózkoncentrációval. A kóros gyökös reakciók ellen az antioxidáns rendszer nyújt védelmet. Az antioxidáns rendszernek számos tagját ismerjük, és - részben - azokat a kóros folyamatokat is feltárták, melyek ellen az antioxidánsok védelmet nyújtanak.⁴

Az elmúlt években kezdték vizsgálni a diabetes mellitus és a gyökfogó rendszer kapcsolatát. Cukorbeteg patkányok vörösvértestjeiben csökkent E-vitamin-, illetve emelkedett lipofuscin-tartalmat találtak.²² Jos és mtsai 1991-ben fiatal inzulin-dependens diabeteseseket és egészséges egyéneket hasonlítottak össze, de nem tudtak különbséget kimutatni a vörösvértestek szuperoxid-dizmutáz-, glutation-peroxidáz- és glutation-reduktáz-aktivitásában, kivéve a retinopathiában szenvedő betegeket, akikben a glutation-peroxidáz-aktivitás csökkent volt.²³ 1991-ben Litvenenko 3 és 14 év közötti inzulin-dependens diabetes mellitusban szenvedő gyerekek vörösvértest-szuperoxid-dizmutáz- és kataláz aktivitását hasonlította össze. A kataláz aktivitásban nem talált különbséget, a szuperoxid-dizmutáz aktivitása azonban a nem megfelelő anyagcsere-egyensúlyú betegekben alacsonyabb volt.²⁴ Fujiwara és mtsai²⁵ nem-inzulin-dependens cukorbetegekben csökkent glutationszintet találtak, Asayama és mtsai²⁶ 1993-ban IDDM-ben szenvedő gyerekek serumában csökkent antioxidáns aktivitást tudtak kimutatni, melyet kapcsolatba lehetett hozni a szénhidrát-anyagcsere rossz beállításával.

Az eddigi vizsgálatok nem tisztázták, hogy kimutatható-e kapcsolat a cukorbetegség fennállási ideje, az inzulinszükséglet, az inzulinrezisztencia, a használt antidiabeticumok, a megfelelő vagy nem megfelelő diéta, a menopausa és a gyökfogó rendszer aktuális állapota között. Feltáratlan ezen eltérések molekuláris biológiai háttere is.

Vizsgálatunk megerősíti azt a feltételezést, hogy a nem megfelelő anyagcsere-helyzetű diabetes mellitus és a hyperlipoproteinaemia önállóan, vagy kombinálódva különböző változásokat okoznak - az érelmeszesedés kialakulási folyamatában feltehetően gátló szerepet játszó - antioxidáns rendszer aktivitásában.

Köszönetnyilvánítás

A vizsgálat a Magyar Diabetes Társaság 1993. évi pályázatán elnyert díj és a Boehringer Mannheim GmbH segítségével készült.

1. Lopes-Virella, MF, Virella, G: Immune mechanisms of atherosclerosis in diabetes mellitus. Diabetes 41 (Suppl 2): 86-91, 1992.

2. Suba I, Halmos T, Kautzky L: A metabolikus X-syndromáról - tények és kétségek. Diabetologia Hungarica I: 15-22, 1993.

3. Somogyi A, Pusztai P, Prechl J, Fehér J: A diabetes mellitus és szabadgyökös reakciók feltételezett kapcsolata az érelmeszesedéssel. Orv Hetil 135: 1815-1818, 1994.

4. Noberasco, G, Odetti, P, Boeri, D, Maiello, M, Adezati, L: Malondialdehyde (MDA) level in diabetic subjects. Relationship with blood glucose and glycosylated hemoglobin. Biomed Pharmacother 45: 193-196, 1991.

5. Blázovics A, Somogyi A: Szabadgyökös reakciók szerepe kísérletes hyperlipaemiában és arteriosclerosisban. Kandidátusi értekezés, Budapest, 1989.

6. Blázovics A, Fehér E, Fehér J: Role of free radical reaction in experimental hyperlipidemia in pathomechanism of fatty liver. In: Csomós G and Fehér J (eds) Free radical and liver. Springer-Verlag, Berlin p: 96-126, 1992.

7. Hunt, JV, Smith, CCT, Worff, SP: Autoxidative glycolization and possible involvement of peroxides and free radicals in LDL modification by glucose. Diabetes 39: 1420-1424, 1990.

8. Tsai, EC, Hirsch, IB, Brunzel, JT, Chait, A: Reduced plasma peroxyl radical trapping capacity and increased susceptibility of LDL to oxidation in poorly controlled IDDM. Diabetes 43: 1010-1014, 1994.

9. Rim, EB, Stamfer, MJ, Ascherio, A, Giovannucci, E, Colditz, GA: Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med 328: 1487-1489, 1993.

10. Williamson, JR, Chang, K, Frangos, M, Hasan, KS, Ido, Y, Kawamura, T, Nyengaard, JR, Van den Enden, M, Kilo, C, Tilton, RG: Hyperglycemic pseudohypoxia and diabetic complications. Diabetes 42: 801-813., 1993.

11. Fehér J, Vereckei A: Szabadgyök-reakciók jelentősége az orvostudományban. Medicina, Biogal, Budapest, 1985.

12. Fujiwara, Z, Kondo, T, Murakami, K, Kawakami, Z: Decrease of the inhibition of lipid peroxidation by glutathione-dependent system in erythrocytes of non-insulin dependent diabetics. Klin Wochenschr 67: 336-341, 1989.

13. Blázovics A, Gonzalez-Cabello, R, Barta I, Fehér J, Kéry Á, Petri G: Effect of liver-protecting Sempervivum tectorum extract on the immune reactivity of spleen cells in hyperlipidemic rats. Phytotherapy Research 8: 33-37, 1994.

14. Vereckei A, Blázovics A, György I, Fehér E, Tóth M, Szénási G, Zsinka Á, Földiák G, Fehér J: The role of free radicals in the pathogenesis of Amiodarone toxicity. J Cardiovasc Electrophysiol 4: 161-171, 1993.

15. Horváth T, Blázovics A: Chemiluminescence in blood systems of alcoholics and of patients with subminimal alcohol-drug uses. Croat J Gastroent Hep 4: 159-163, 1992.

16. Somogyi A: Diabetes mellitus és hyperlipoproteinaemia. Orv Hetil 134: 17-23, 1993.

17. Lindenstrom, E, Budrun, G, Nyboe, J: Influence of total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol, and triglicerides on risk of cerebrovascular disease: the Copenhagen city heart study. BMJ 309: 11-15, 1994.